MultiTarget® THR KIT

Método de diagnóstico in vitro para la detección y discriminación alélica para Factor V Leide (rs6025) y Protrombina G20210A (rs1799963), en pacientes con sospecha de trombofilia y síntomas asociados.
La trombosis tiene un papel crucial en las tres causas más importantes de muerte cardiovascular en el mundo:
• el infarto agudo de miocardio
• el accidente cerebrovascular
• el tromboembolismo venoso.
Variantes genéticas en los genes que codifican para factores o inhibidores de la coagulación son importantes factores de riesgo tromboembólico.
La forma más frecuente de trombofilia hereditaria se debe al Factor V de Leiden en donde la sustitución del nucleótido G por el nucleótido A en la posición 1601 en el gen F5 (c.1601G>A – rs6025 ) provoca el reemplazo en la proteína (Factor V) de una Arginina por una Glutamina en la posición 504 (p.Arg504Gln/R504Q ). De esta forma el Factor Va anómalo no puede inactivarse por la APC, continúa activado y aumenta la probabilidad de trombogénesis. El riesgo de las manifestaciones del proceso depende del número de copias genómicas alteradas por cada célula, de forma que si únicamente presenta la mutación uno de los dos alelos (heterocigótico), el riesgo de manifestar el proceso es menor, que cuando las copias de ambos alelos están afectadas (homocigótico).
La Protrombina (Factor II) es el precursor de la Trombina, el efector final de la cascada de la coagulación que conduce a la formación de Fibrina. La presencia de la sustitución del nucleótido G por el nucleótido A en la posición 97 en la región 3’ no codificante del gen F2 (c.*97G>A - rs1799963) que codifica para la Protrombina humana, está asociada con un aumento de los niveles plasmáticos de la proteína con el consecuente incremento en el riesgo (2,8 veces) de desarrollar trombosis venosa, infarto de miocardio y trombosis en venas cerebrales. El riesgo de las manifestaciones del proceso depende del número de copias genómicas alteradas por cada célula. Las personas que presentan la mutación en uno de los dos alelos (heterocigótico) tienen 6 veces más probabilidades de sufrir una trombosis que la población normal. Las mujeres jóvenes portadoras de la mutación tienen un riesgo 4 veces mayor de sufrir un infarto de miocardio, mientras que en los hombres el riesgo se incrementa en 1,5 veces. Este riesgo se incrementa aún más si se da el uso de anticonceptivos, la terapia de estrógenos, el tabaquismo, la diabetes o la hipertensión arterial.

FUNDAMENTO DEL MultiTarget® THR KIT:
Se basa en la tecnología de Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo real (qPCR) para la detección específica de los alelos con y sin la variante c.1601G>A (rs6025) en el gen F5 o la variante G20210A (rs1799963) en el gen F2.
A partir de ADN genómico (ADNg) purificados de sangre entera anticoagulada con EDTA, se realiza la amplificación mediante qPCR utilizando cebadores específicos y sondas de hidrólisis (tipo TaqMan®). Estas sondas son oligonucleótidos conjugados con un fluoróforo en el extremo 5’ y una molécula extintora (quencher) en el extremo 3’ la cual por transferencia de energía de resonancia fluorescente inhibe la emisión del fluoróforo cuando se encuentra cercana. La mezcla de reacción contiene dUTP y la enzima UNG para evitar la contaminación residual (carry over). La reacción se lleva a cabo mediante la acción de una enzima Hot-Start Fast ADN polimerasa con actividad exonucleasa y tolerante a los inhibidores más comunes, que provoca la degradación de la sonda separándose el fluoróforo de la molécula extintora (quencher). El aumento de la señal de fluorescencia resultante por acumulación del ADN templado es detectado por el instrumento de qPCR en los canales:
• VIC/JOE/HEX para detección del alelo no mutado del Factor II o del Factor V,
• FAM para detección del alelo mutado del Factor II o del Factor V.
Además, se provee un control positivo para los alelos mutados y no mutados de los genes F5 y F2, y agua libre de nucleasas para su uso como control de reactivos a fin de validar cada ensayo.
Presentaciones
• Kit para 25 determinaciones
• Kit para 50 determinaciones
• Kit para 100 determinaciones
PRODUCTO IVD AUTORIZADO POR ANMAT N° PM 2900-1
Tecnología
PCR en tiempo real
Tipo de Análisis
Cualitativo
Secuencia Diana
Factor V Leiden: c.1601G>A del gen F5 (rs6025)
Protrombina G20210A: c.*97G>A del gen F2 (rs1799963)
Tipo de Muestra Validada
Sangre entera anticoagulada con EDTA
Reproducibilidad
Repetitividad
Precisión intra-laboratorio
100%
100%
100%
[ADN genómico]
Pureza ADN genómico
rango óptimo: 1,0 a 50 ng/μl (5 a 250 ng/reacción)
relación A260/280 entre 1,8 y 2,0
Interferente
Heparina a altas concentraciones (260 U/ml)
Concordancia porcentual
(356 muestras)
Positiva (PPA): 100%
Negativa (NPA): 100%
General (OPA): 100%
Almacenamiento
-20°C
Métodos de extracción verificados
• NucleoSpin Blood, Mini kit for DNA from blood (Macherey-Nagel, Alemania).
•  ADN PuriPrep-S Kit (Inbio Highway, Argentina).
• MagNA Pure 24 Total NA Isolation Kit (Roche, Suiza).
• MagCore® Genomic DNA Whole Blood (RBC Bioscience, Taiwan).
Instrumentos compatibles
• QuantStudio® 3 (Applied Biosystems)
• StepOne Plus® (Applied Biosystems)
• Applied Biosystems 7500® (Applied Biosystems).
• CFX96® (Biorad).
• Rotor Gene Q® (Qiagen).
• Light Cycler 480® (Roche).
• Mic® qPCR Thermal Cycler - 4 (Biomolecular Systems).
Canales de detección requeridos
FAM (492 nm / 516 nm) – YAK (530 nm / 550 nm) [2]
Evaluación de calidad externa
Fellner MD y col, 2021 (DOI: 10.3390/genes12050659)
Certificación
PRODUCTO AUTORIZADO POR ANMAT
N° PM-2900-1
DETECCIÓN DE PATÓGENOS
MultiTarget® NeuroV KIT I
Detección cualitativa de los virus  HSV-I, HSV-II y VZV
a partir de muestras de
líquido cefalorraquídeo.
MultiTarget® NeuroV KIT II
Detección cualitativa de los virus  CMV, EBV y EV
a partir de muestras de
líquido cefalorraquídeo.
MultiTarget® Dengue Sc & Type
Detección cualitativa de los distintos sero/genotipos del virus Dengue (DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4)a partir de muestras de suero o plasma.
MultiTarget® ITS Ferti KIT I
Detección cualitativa de Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae y Mycoplasma genitalium a partir de muestras de exudado endocervical, exudado uretral y orina.
MultiTarget® ITS Ferti KIT II
Detección cualitativa de Trichomonas vaginalis, Mycoplasma hominis y Ureaplasma spp a partir de muestras de exudado endocervical, exudado uretral y orina.
MultiTarget® TBC+Res KIT
Detección cualitativa del complejo Mycobacterium tuberculosis y de las principales variantes de resistencia a rifampicina e isoniazida a partir de muestras respiratorias.
DETECCIÓN DE VARIANTES GÉNICAS
MultiTarget® THR Plus KIT
Detección cualitativa de los alelos normal y mutado para la variante 4G/5G del gen SERPINE (PAI-1) y las variantes c.677C>T y c.1298A>C del gen MTHFR a partir de muestras de sangre entera.
MultiTarget® HFE 3v KIT
Detección cualitativa de los alelos normal y mutado para las variantes más frecuentes de Hemocromatosis Hereditaria tipo I (C282Y, H63D y S65C del gen HFE) a partir de muestras de suero o plasma.