La trombosis tiene un papel crucial en las tres causas más importantes de muerte cardiovascular en el mundo:
• el infarto agudo de miocardio
• el accidente cerebrovascular
• el tromboembolismo venoso.
Variantes genéticas en los genes que codifican para factores o inhibidores de la coagulación son importantes factores de riesgo tromboembólico.
El Inhibidor del Activador del Plasminógeno tipo 1 (PAI-1) es el principal inhibidor fisiológico de la actividad del sistema fibrinolítico mediante la inhibición del Activador del Plasminógeno tisular (tPA) y del Activador del Plasminógeno tipo uroquinasa (uPA), por lo que un incremento en su concentración plasmática se asocia a eventos trombóticos. El polimorfismo rs1799762 que consiste en una sola inserción/deleción de un nucleótido guanina (G) en la posición 675 de la región promotora del gen SERPINE1 (cromosoma 7q22.1) tiene una acción reguladora de la concentración plasmática de PAI-1. Esta deleción (alelo 4G) provoca que represores transcripcionales no puedan unirse a la región promotora lo que se traduce en un incremento en la expresión de PAI-1, favoreciendo la disminución en la actividad del sistema fibrinolítico. Los individuos con la deleción en ambos alelos (homocigotos 4G/4G) o en uno solo de ellos (heterocigotos 4G/5G) presentan concentraciones plasmáticas de PAI-1 más elevadas que los individuos sin la deleción en ambos alelos, aumentando el riesgo de eventos trombóticos.
La metionina es un aminoácido esencial y se metaboliza a homocisteína por un conjunto de enzimas relacionadas al metabolismo del ácido fólico y las vitaminas B6 y B12. El déficit hereditario de la enzima metilentetrahidrofolato reductasa codificada por el gen MTHFR (cromosoma 1p36.3), es una de las causas de homocistinuria. Los principales polimorfismos del gen asociados a disminución en la actividad enzimática son:
• c.677C>T/p.Arg222Val (rs1801133): la presencia de esta variante se relaciona con un incremento de la homocisteína en el suero y una redistribución de los folatos, con aumento del riesgo de padecer una enfermedad cardiovascular, y otras patologías. Un 5-15% de las personas normales son homocigotas TT para esta variante.
• c.1298A>C/p.Glu429Ala (rs1801131): la presencia de esta variante se relaciona al descenso en la actividad de la enzima, los estados heterocigota u homocigota CC no se encuentran asociados con el aumento de homocisteína o disminución de folato en plasma. Sin embargo, la heterocigosidad combinada de c.1298A>C y c.677C>T está asociada con una reducción de la actividad específica de la enzima, homocisteína elevada y descenso en las concentraciones plasmáticas de folato.
FUNDAMENTO DEL MultiTarget® THR Plus KIT:
Se basa en la tecnología de Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo real (qPCR) para la detección específica de los alelos con y sin la variante 4G/5G (rs1799762) en el gen SERPINE que codifica para el PAI-1 o las variantes c.665C>T (C677T - rs1801133) y c.1286A>C (A1298C - rs1801131) en el gen MTHFR.
A partir de ADN genómico (ADNg) purificados de sangre entera anticoagulada con EDTA, se realiza la amplificación mediante qPCR utilizando cebadores específicos y sondas de hidrólisis (tipo TaqMan®). Estas sondas son oligonucleótidos conjugados con un fluoróforo en el extremo 5’ y una molécula extintora (quencher) en el extremo 3’ la cual por transferencia de energía de resonancia fluorescente inhibe la emisión del fluoróforo cuando se encuentra cercana. La mezcla de reacción contiene dUTP y la enzima UNG para evitar la contaminación residual (carry over). La reacción se lleva a cabo mediante la acción de una enzima Hot-Start Fast ADN polimerasa con actividad exonucleasa y tolerante a los inhibidores más comunes, que provoca la degradación de la sonda separándose el fluoróforo de la molécula extintora (quencher). El aumento de la señal de fluorescencia resultante por acumulación del ADN templado es detectado por el instrumento de qPCR en los canales:
• VIC/JOE/HEX para detección del alelo no mutado del PAI-1, MTHFR677 o MTHFR1298,
• FAM para detección del alelo mutado del PAI-1, MTHFR677 o MTHFR1298.
Además, se provee un control positivo para los alelos mutados y no mutados de los genes SERPINE (PAI-1) y MTHFR, y agua libre de nucleasas para su uso como control de reactivos a fin de validar cada ensayo.
• el infarto agudo de miocardio
• el accidente cerebrovascular
• el tromboembolismo venoso.
Variantes genéticas en los genes que codifican para factores o inhibidores de la coagulación son importantes factores de riesgo tromboembólico.
El Inhibidor del Activador del Plasminógeno tipo 1 (PAI-1) es el principal inhibidor fisiológico de la actividad del sistema fibrinolítico mediante la inhibición del Activador del Plasminógeno tisular (tPA) y del Activador del Plasminógeno tipo uroquinasa (uPA), por lo que un incremento en su concentración plasmática se asocia a eventos trombóticos. El polimorfismo rs1799762 que consiste en una sola inserción/deleción de un nucleótido guanina (G) en la posición 675 de la región promotora del gen SERPINE1 (cromosoma 7q22.1) tiene una acción reguladora de la concentración plasmática de PAI-1. Esta deleción (alelo 4G) provoca que represores transcripcionales no puedan unirse a la región promotora lo que se traduce en un incremento en la expresión de PAI-1, favoreciendo la disminución en la actividad del sistema fibrinolítico. Los individuos con la deleción en ambos alelos (homocigotos 4G/4G) o en uno solo de ellos (heterocigotos 4G/5G) presentan concentraciones plasmáticas de PAI-1 más elevadas que los individuos sin la deleción en ambos alelos, aumentando el riesgo de eventos trombóticos.
La metionina es un aminoácido esencial y se metaboliza a homocisteína por un conjunto de enzimas relacionadas al metabolismo del ácido fólico y las vitaminas B6 y B12. El déficit hereditario de la enzima metilentetrahidrofolato reductasa codificada por el gen MTHFR (cromosoma 1p36.3), es una de las causas de homocistinuria. Los principales polimorfismos del gen asociados a disminución en la actividad enzimática son:
• c.677C>T/p.Arg222Val (rs1801133): la presencia de esta variante se relaciona con un incremento de la homocisteína en el suero y una redistribución de los folatos, con aumento del riesgo de padecer una enfermedad cardiovascular, y otras patologías. Un 5-15% de las personas normales son homocigotas TT para esta variante.
• c.1298A>C/p.Glu429Ala (rs1801131): la presencia de esta variante se relaciona al descenso en la actividad de la enzima, los estados heterocigota u homocigota CC no se encuentran asociados con el aumento de homocisteína o disminución de folato en plasma. Sin embargo, la heterocigosidad combinada de c.1298A>C y c.677C>T está asociada con una reducción de la actividad específica de la enzima, homocisteína elevada y descenso en las concentraciones plasmáticas de folato.
FUNDAMENTO DEL MultiTarget® THR Plus KIT:
Se basa en la tecnología de Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo real (qPCR) para la detección específica de los alelos con y sin la variante 4G/5G (rs1799762) en el gen SERPINE que codifica para el PAI-1 o las variantes c.665C>T (C677T - rs1801133) y c.1286A>C (A1298C - rs1801131) en el gen MTHFR.
A partir de ADN genómico (ADNg) purificados de sangre entera anticoagulada con EDTA, se realiza la amplificación mediante qPCR utilizando cebadores específicos y sondas de hidrólisis (tipo TaqMan®). Estas sondas son oligonucleótidos conjugados con un fluoróforo en el extremo 5’ y una molécula extintora (quencher) en el extremo 3’ la cual por transferencia de energía de resonancia fluorescente inhibe la emisión del fluoróforo cuando se encuentra cercana. La mezcla de reacción contiene dUTP y la enzima UNG para evitar la contaminación residual (carry over). La reacción se lleva a cabo mediante la acción de una enzima Hot-Start Fast ADN polimerasa con actividad exonucleasa y tolerante a los inhibidores más comunes, que provoca la degradación de la sonda separándose el fluoróforo de la molécula extintora (quencher). El aumento de la señal de fluorescencia resultante por acumulación del ADN templado es detectado por el instrumento de qPCR en los canales:
• VIC/JOE/HEX para detección del alelo no mutado del PAI-1, MTHFR677 o MTHFR1298,
• FAM para detección del alelo mutado del PAI-1, MTHFR677 o MTHFR1298.
Además, se provee un control positivo para los alelos mutados y no mutados de los genes SERPINE (PAI-1) y MTHFR, y agua libre de nucleasas para su uso como control de reactivos a fin de validar cada ensayo.
